В противоположность этому средняя анизотропия r определяется как

(5.6)


где r_i- — анизотропия индивидуальных форм. Ясно, что последнее выраже­ние предпочтительнее. Более того, затухание анизотропии флуоресценции [r (t)] сферы после импульсного возбуждения записывается в виде

(5.7)

где r₀ - анизотропия в момент t = 0; φ - время вращательной корреляции сферы. Затухание поляризации не подчиняется одноэкспоненциальному за­кону даже для сферической молекулы.

ПРОИСХОЖДЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЙ ПОЛЯРИЗАЦИИ И АНИЗОТРОПИИ. Может вызвать удивление, почему для одного и того же явления существуют две широко используемые меры. Как Р, так и r имеют рациональное происхож­дение. Рассмотрим частично поляризованный свет, направленный вдоль оси х (рис. 5.2) и предположим, что измеряют интенсивности /_z и 1_у детектором, ориентированным вдоль оси х. Поляризация этого света определяется как доля света, который поляризован линейно. Иначе говоря,

(5.8)


где р - интенсивность поляризованной составляющей; п — интенсивность естественной компоненты, которая дается выражением n = 2I_y .Остающаяся интенсивность является поляризованной составляющей и равна Р =I_z-I_y . Для вертикально поляризованного возбуждения I_z = I_|| и 1_у = I_┴ . Подстановка в уравнение (5.8) дает уравнение (5.1), которое и яв­ляется стандартным определением поляризации.

Анизотропия r источника света определяется как отношение поляри­зованной составляющей к общей интенсивности I_общ :

(5.9)


Если возбуждение поляризовано вдоль оси z, то оно симметрично по отно­шению к х и у. Как результат, дипольное излучение флуорофора также симметрично по оси z. Следовательно, /_х = I_y . Учитывая, что 1_у = 1_┴ и I_z = I_|| , получаем уравнение (5.2).

П
оляризация - более полезный и удобный параметр для описания ис­точника света, когда свет направлен вдоль выбранного направления, как по­казано в верхней части рис. 5.2. В этом случае р + п — общая интенсивность и Р - отношение избыточной интенсивности вдоль оси z, поделенной на об­щую интенсивность.

РИС. 5.2. Схематическое представление поляризации и анизотропии света.

В противоположность этому излучение, испускаемое флуорофором, симметрично распределено вдоль оси z (нижняя часть рис. 5.2). По этой причине общая интенсивность дается не выражением I_|| +I_┴ , a I_общ= I_|| +2I_┴. Это происходит потому, что свет, излучаемый диполем, равномерно распределен вдоль осей х и у. Следовательно, анизотропия пред­ставляет собой отношение избыточной интенсивности, которая параллельна оси z, к общей интенсивности. С этой точки зрения параметр поляризации, возможно, неудобен для описания испускания флуоресценции. Однако он был принят в оригинальной литературе, и большинство теорий изложено с исполь­зованием этого термина. Этот параметр все еще широко применяют, но воз­растает и использование анизотропии. Вероятно, одной из причин предпоч­тения, отдаваемого поляризации, была та, что возбуждение направленным пучком правильнее описывается параметром поляризации. Понятно, что тот же самый параметр затем был применен для описания испускания флуорес­ценции, хотя пространственное распределение этого испускания другое.

5.2. Теория поляризации для разбавленных растворов, находящихся в стеклообразном состоянии

Анизотропия флуоресценции, измеряемая в разбавленных стеклообраз­ных растворах, определяется собственными спектральными свойствами флуорофоров. Это происходит потому, что высокая вязкость раствора препятст­вует заметной вращательной диффузии до испускания. Более того, в очень разбавленных растворах ни перенос энергии, ни реабсорбция не могут выз­вать деполяризацию испускания. Этот особый случай будет описан детально потому, что его обсуждение без чрезмерного усложнения выявляет фунда­ментальные свойства анизотропии.

Теория поляризации флуоресценции основывается на рассмотрении флуорофора как осциллирующего диполя, имеющего момент



где ω_L - круговая частота испускаемого света; t — время. Естественно, флуорофор испускает отдельные фотоны. Однако пространственная зависи­мость энергии точно описывается классическими (не квантовыми) теория­ми электричества и магнетизма. Предположим, что данный флуорофор ориентирован вдоль оси z, как показано на рис. 5.2. Пространственное распределение энергии, излучаемой осциллирующим диполем, идентично распределению излучения антенны, которая также является осциллирую­щим диполем. Электрическое поле А такого диполя на определенном расстоя­нии пропорционально sin ψ где ψ - угол по отношению к оси z:




Испускаемая энергия и, следовательно, наблюдаемая интенсивность I про­порциональны квадрату интенсивности электрического поля. Следовательно,

Применительно к поляризации флуоресценции наиболее важной харак­теристикой излучаемого света является его круговое симметричное распре­деление вдоль оси z. Для диполя, ориентированного вдоль оси z, следует ожидать одинаковой интенсивности света в направлениях у и х. Интересно отметить, что в направлении оси z нельзя наблюдать этот осциллирующий диполь, так как вдоль этого направления энергия не излучается. Мы будем говорить о моментах переходов при возбуждении и испускании как о погло­щающих и испускающих диполях.

РИС. 5.3. Система координат дпя флуорофора.


Рассмотрим флуорофор, диполи поглощения и испускания которого па­раллельны. Это практически верно для 1,6-дифенилгексатриена (рис. 5.3), который широко используется как зонд при изучении биологических мембран. В данный момент примем, что эта молекула ориентирована под углом в по отношению к оси z и ф - по отношению к оси у. Естественно, молекулы DPH будут случайным образом ориентированы в изотропном и гомогенном стекло­образном растворителе, и возбуждение поляризованным светом отбирает определенный диапазон ориентации (разд. 5.2.1). Пусть нужно вычислить ани­зотропию, которая наблюдалась бы для этой молекулы в стеклообразном растворе. Предварительное условие параллельности диполей, неподвижность и случайный характер ориентации упрощают вывод. Тем не менее рассмот­рение этого простого случая иллюстрирует смысл измеряемого значения анизотропии.

Интенсивность света, излученного диполем, пропорциональна квадрату проекции его вектора на ось наблюдения. Следовательно,

(5.10), (5.11)


В реальных экспериментах возбуждение будет направлено вдоль оси х. При этом с одинаковой вероятностью должны возбудиться все молекулы, имею­щие равные углы 9, т.е. популяция возбужденных флуорофоров будет сим­метрично распределена вокруг оси z, Любая экспериментально доступная популяция молекул будет ориентирована так, что угол ф будет принимать значения от 0 до 2 π с равной вероятностью. Следовательно, мы можем ис­ключить зависимость от φ в уравнении (5.11). Среднее значение sin²φ опре­деляется выражением

(5.12)

и, следовательно,

(5.13),(5.14)


Теперь предположим, что наблюдаем набор флуррофоров, которые ориенти­рованы по отношению к оси z с вероятностью f(θ). В следующем разделе будет рассмотрен вид f(θ), предполагаемый для случайного распределения. Измеряемые интенсивности флуоресценции для этого набора молекул равны:




(5.15)



(5.16)

где f(θ)dθ — вероятность того, что флуорофор ориентирован между θ и θ + dθ. Используя уравнение (5.2) и равенство sin²θ = 1 — cos^aθ, можно по­казать, что

(5.17)

Следовательно, величина анизотропии на самом деле является мерой сред­него значения cos ²θ, где θ — угол диполя испускания по отношению к оси z. Это происходит потому, что наблюдаемые интенсивности I_|| и I_┴ пропорцио­нальны квадрату проекций индивидуальных моментов перехода на оси х и z (см. рис. 5.2). Полезно рассмотреть взаимосвязь между r и θ. Рассеянный свет полностью поляризован, следовательно, θ = 0 и r =1,0. Полное исчез­новение анизотропии эквивалентно θ = 54,7°. Это не означает, что каждый флуорофор поворачивается на 54,7°, но среднее значение cos²θ =1/3, где θ -угловое смещение между диполями возбуждения и испускания. Напомним, чт( при выводе уравнения (5.17) предполагалось, что эти диполи параллельны. Не сколько более сложное выражение необходимо практически для всех флуоро-форов, поскольку диполи редко бывают параллельны. К тому же мы еще не рассмотрели влияние фотоотбора на величину анизотропии.

ВОЗБУЖДЕНИЕ И ФОТООТБОР ФЛУОРОФОРОВ. Для наблюдения флуорес­ценции флуорофоры, разумеется, необходимо возбудить. Электрический диполь флуорофора не обязательно должен точно совпадать с направлением оси z для поглощения света, поляризованного вдоль этой оси. Вероятность поглощения пропорциональна cos² θ, где θ — угол, образуемый диполем пог­лощения с осью z [ 3]. Следовательно, возбуждение поляризованным светом приводит к появлению популяции возбужденных флуорофоров, которая сим­метрично распределена вокруг оси z (рис. 5.4).



РИС. 5.4. Схемы, иллюстрирующие фотоотбор и вероятность распределения флуорофоров.


Это явление называется фотоотбором. Распределение cos²θ видоизменяется в дальнейшем путем учета вероятности того, что молекула образует угол θ с осью z. Для случайного распределения, которое должно существовать в неупорядоченном растворе, число молекул с величиной угла между 6 и 9 + dθ пропорционально sinθdθ, a также площади поверхности на сфере внутри угла от θ до θ + dθ. Следо­вательно, распределение возбужденных вертикально поляризованным све­том молекул выражается как

(5.18)


Распределение вероятности, даваемое уравнением (5.18), определяет мак­симум отбора, который может быть достигнут при использовании оптичес­кого возбуждения изотропного раствора. Напомним [уравнение (5.17)], что анизотро­пия является просто линейной функцией cos²θ. Следовательно, для одно­направленных диполей поглощения и испускания максимальные значения cos²θдаютсявыражением


(5.19)

Подстановка (5.18) в (5.19) дает cos²θ = 3/5. С учетом уравнения (5.17) мож­но найти максимальную анизотропию, равную 0,4, Это значение получается, когда диполи поглощения и испускания параллельны и нет других процессов, приводящих к деполяризации. Легко заметить, что это значение (0,4) гораз­до меньше, чем возможное для рассеянного света (1,0). Фактически, если измеренная анизотропия для случайно ориентированного образца больше чем 0,4, можно уверенно сделать вывод о присутствии рассеянного света в до­полнение к флуоресценции. Максимальное значение анизотропии 0,4 для па­раллельных диполей поглощения и испускания является следствием того, что вероятность поглощения света равна cos ² θ.