https://electroinfo.net

girniy.ru 1
КАЛЛУСОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ РЕМОНТАНТНЫХ ФОРМ МАЛИНЫ


И. А. Райков

Брянская государственная сельскохозяйственная академия, E-mail: [email protected]


Малина ремонтантная - скороплодная и урожайная культура. Отличительной особенностью которой является однолетний цикл формирования урожая. Подзимнее удаление побегов снимает проблему зимостойкости надземной части растений, также удаление с поля вегетативной массы значительно упрощает защиту растений малины от болезней и вредителей [1].

Существенную помощь в реализации генетического потенциала малины ремонтантной способны оказать методы биотехнологии, которые существенно ускоряют селекционный процесс. Немалый интерес у селекционеров вызывает гаплоидия [2].

Важной особенностью гаплоидов является отсутствие явления доминантности. Генотип таких растений соответствует их фенотипу, что позволяет использовать такие растения в селекционных программах. Растения такого типа отличаются менее сложным генетическим расщеплением, что позволяет выявлять определенные комбинации генов в сравнительно малочисленных популяциях [3].

Интерес селекционеров к гаплоидам связан с возможностью их использования в качестве посредников для получения гомозиготных растений, образуемых путем удвоения числа хромосом [2].

У гаплоидов теоретической гомозиготности можно добиться в течение одного поколения, что дает гаплоидии несомненное преимущество перед традиционными методами селекции.

Несмотря на значительный интерес, проявляемый к методу гаплоидии in vitro, он не имеет широкого практического применения в связи с низкой эффективностью. Разработанные методики получения гаплоидов не являются универсальными в связи, с чем необходимо проводить дальнейшие исследования в этом направлении.

В настоящее время при использовании методов гаплоидии получены сорта риса, пшеницы, табака и других культур. Андрогенез in vitro плодово-ягодных культур в настоящее время мало изучен.


Целью нашего исследования было оптимизация методики получения гаплоидных растений малины ремонтантной.

При проведении эксперимента использовали растения малины ремонтантной сорта Оранжевое чудо селекции Кокинского опорного пункта ВСТИСП. Сбор бутонов проводили в начале сентября в сухую, солнечную погоду.

Выбирали бутоны, не имеющие белого конуса, пыльники которых окрашены в зеленовато-желтый цвет. Собранный материал на 4 дня помещали в холодильник, что, по мнению некоторых исследователей, способствует переключению микроспор на спорофитный путь.

Для культивирования пыльников использовалась питательная среда содержащая минеральные компоненты и витамины по прописи Мурасиге-Скуга [4] с увеличенной в 3 раза концентрацией хелата железа. В качестве источников углеводов использовали сахарозу в количестве 30 г/л, а для придания среде полутвердой консистенции – агар-агар в концентрации 0,7 %.

В качестве индукторов каллусогенеза применяли регуляторы роста ауксиновой (НУК – нафтилуксусная кислота, ИУК – индолилуксусная кислота, ИМК – индолилмасляная кислота, 2,4-Д – 2,4- Дихлорфеноксиуксусная кислота) и цитокининовой (К – кинетин, CPPU - N-(2 хлор-4-пиридил)-N-фенилмочевина, BA – 6-бензиламинопурин) природы в различных концентрациях. Исследовали 4 варианта сочетаний фитогормонов.

I – К -2мг/л, BA - 1мг/л, ИУК - 3мг/л, 2,4-Д – 0,8мг/л;

II – К - 1мг/л, нук - 1мг/л, ИУК - 1мг/л, ИМК - 1мг/л, CPPU- 0,05мг/л;

III – ИУК - 1мг/л, НУК - 1мг/л, ИМК - 1мг/л, CPPU – 0.1мг/л; I

V – К -1мг/л, НУК - 1мг/л, ИУК - 1мг/л, ИМК - 1мг/л.

Культивирование пыльников проводили темноте. Учеты проводили через 3 месяца культивирования.

В процессе культивирования пыльников была выявлена высокая степень контаминации изолированных эксплантов сапрофитной микрофлорой. В зависимости от варианта этот показатель составил от 52,6% до 92,4%.

Частота каллусообразования во всех использованных вариантах оказалась достаточно низкой и не превышала 4,8% (табл. 1). В работе проведенной сотрудниками НИИ генетики и селекции плодовых растений (г.Мичуринск) на растениях малины также была отмечена низкая каллусообразовательная активность [5].


Таблица 1- Каллусогенезгенез малины ремонтантной in vitro


Вариант

Изолировано

пыльников, шт*

Частота каллусообразование,

%

I

207

0,5

II

405

1,9

III

62

4,8

IV

105

0,9

* без учета инфицированных

Реакция культивируемых пыльников на действие регуляторов роста была различна. Наибольшую реализацию каллусообразовательного потенциала удалось получить на средах содержащих в комплексе регуляторов роста CPPU (II, III вариант). В нашей лаборатории получены положительные результаты по использованию производных дифенилмочевины (тидиазурон, 4-PU, CPPU) в качестве индукторов регенарационных процессов при введении эксплантов ягодных растений в культуру in vitro и адвентивном органогенезе.

Полученные каллусные культуры в зависимости от варианта характеризовались различными морфобиологическими показателями. Можно выделить два типа каллусной ткани:

1) темноокрашенные, плотные, не имеющие четкой формы, с признаками слабой гипероводненности;

2) светлоокрашенные, почти белые, имеют шарообразную форму, плотную консистенцию.

В опубликованных работах по андрогенезу in vitro также был отмечен низкий каллусообразовательный потенциал пыльников растений малины ремонтантной. Так, пыльники сорта Оранжевое чудо, на среде MS не образовали ни одного каллуса при разных сочетаниях ауксинов и цитокининов. Однако использование питательной среды N6 позволило увеличить частоту каллусообразования до 7,1%. Также особое внимание уделяется фазе развития растения – донора [5].


Использование нами CPPU в качестве одного из компонентов гормонального комплекса регуляции роста и развития растений позволило увеличить выход каллусов на пыльниках малины ремонтантной на стандартной среде MS.


Литература

1. Казаков, И.В. Малина ремонтантная /И.В. Казаков, С.Н. Евдокименко. – М., Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Россельхозакадемии. – 2007. – 288 с.

2. Данвелл Дж. М. Культуры гаплоидных клеток // В кн.: Биотехнология растений: культура клеток. М., 1989. С. 97-127.

3. Ницше, В. Гаплоиды в селекции растений / В. Ницше, Г. Венцель. – М.: Колос, 1980. – 128 с.

4. Murashige Т.А. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / Т.А. Murashige & F. Skoog // Physiologia Plantarum.- 1962.- V.15. – N. 13.- P. 473-497.

5. Савельев Н. И. Андрогенез in vitro малины и земляники. / Н.И. савельев,О.Я. Олейникова, Н.С. Ильина // Вестник МичГАУ. –1. – 2008. ­­– С.12-15.